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原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell, PGC）是精子和卵子在胚胎期的祖先細(xì)胞（progenitor cell），是遺傳物質(zhì)代際傳遞的細(xì)胞載體。因此，PGC是開展基因編輯和轉(zhuǎn)基因等遺傳操作的理想靶細(xì)胞。將遺傳操作后的PGC移植入內(nèi)源PGC剔除的受體胚，利用受體高效產(chǎn)生遺傳操作的供體配子，一方面可以顯著提升遺傳操作的效率，有望獲得致死基因的母源合子突變體（J Genet Genomics，2020；Faculty of 1000推薦）；另一方面有可能通過跨物種的PGC移植實(shí)現(xiàn)種間借腹生殖（Science China Life Science, 2022），突破精準(zhǔn)高效的定向育種。因此PGC移植技術(shù)已成為動物遺傳操作和定向育種領(lǐng)域亟待突破和發(fā)展的重要技術(shù)。
圖1 斑馬魚等魚類早期胚胎中僅存在極少數(shù)目的PGC
然而，供體胚胎往往僅具有極少數(shù)目的PGC，比如1000-細(xì)胞期的斑馬魚胚胎僅有4顆PGC（圖1），嚴(yán)重限制了PGC移植的成功率。如何建立一種普適高效的PGC誘導(dǎo)技術(shù)，成為這一領(lǐng)域亟待解決的首要科學(xué)和技術(shù)難題。在動物界，PGC特化存在兩種不同的模式：一種是以小鼠為代表的“后成論（Epigenesis）”，是指周圍信號誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)獲得PGC特性；另一種是以果蠅、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚和非洲爪蟾為代表的“先成論（Preformation）”，是指從母體繼承的生殖質(zhì)（germplasm）因子直接決定了生殖細(xì)胞命運(yùn)。在“后成論”動物中，已有少量誘導(dǎo)型PGC（induced PGC，iPGC）成功的報(bào)道（Nature，2013；Science，2022），但在“先成論”動物中尚沒有取得iPGC的突破。
中國科學(xué)院水生生物研究所孫永華團(tuán)隊(duì)長期從事魚類生殖細(xì)胞發(fā)育與生物技術(shù)研究。前期以斑馬魚和稀有鮈鯽為模型，初步建立了魚類單因子PGC異位誘導(dǎo)（J Genet Genomics，2020；Faculty of 1000推薦）和跨亞科物種間生殖干細(xì)胞移植借腹生殖（Science China Life Science, 2022）技術(shù)。12月14日，孫永華團(tuán)隊(duì)在國際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications發(fā)表了題為“Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors”的研究論文，首次采用“先成論”策略在斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎中高效誘導(dǎo)出iPGC，為硬骨魚類的PGC誘導(dǎo)和PGC移植借腹生殖建立了一個(gè)新范式。
為了高效地誘導(dǎo)魚類PGC，作者首先將與PGC特化密切相關(guān)的9個(gè)生殖質(zhì)因子（9GM：ddx4，dazl，piwil1，dnd1，nanos3，tdrd6，tdrd7a， dazap2，buc）和與PGC遷移相關(guān)的4個(gè)因子（4GM：rgs14a，cxcr4a，cxcr4b，ca15b）一同注射到1-細(xì)胞的斑馬魚胚胎中，發(fā)現(xiàn)幾乎所有胚盤細(xì)胞都變成GFP-UTRnanos3陽性的類PGC細(xì)胞。去除與PGC遷移相關(guān)的4因子后，9GM仍能高效的誘導(dǎo)出類PGC細(xì)胞。將誘導(dǎo)的類PGC細(xì)胞移植到內(nèi)源PGC剔除的受體胚中，類PGC可以正確遷移到生殖嵴（圖2），且起始表達(dá)內(nèi)源生殖質(zhì)基因，表明這些類PGC具有典型的PGC特征，是真正的iPGC。
圖2 9GM將斑馬魚胚盤細(xì)胞高效誘導(dǎo)為iPGC
接下來，研究人員使用Tg(cmv:GFP)和Tg(cmv:mCherry)轉(zhuǎn)基因胚胎分別作為iPGC移植的供體和受體。通過連續(xù)追蹤iPGC移植性腺的發(fā)育，發(fā)現(xiàn)嵌合體性腺生殖細(xì)胞均表達(dá)GFP，性腺體細(xì)胞均表達(dá)mCherry。最終，利用表達(dá)mCherry的親本產(chǎn)出了表達(dá)GFP的iPGC移植配子，其子代也能正常發(fā)育和繁殖。這表明，iPGC移植后能夠正常發(fā)育為成熟的配子。為了進(jìn)一步證明9個(gè)生殖質(zhì)因子能夠?qū)⑷魏我粋€(gè)胚胎細(xì)胞誘導(dǎo)為iPGC，作者嘗試將9GM注射入128-細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚胚胎的單個(gè)胚盤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)無論注射到動物極，還是胚盤邊緣的單胚盤細(xì)胞，9GM均能將該胚盤細(xì)胞誘導(dǎo)為iPGC，并進(jìn)一步產(chǎn)生功能性配子，這表明9GM能夠?qū)⑷我慌弑P細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPGC。
重要的是，這種誘導(dǎo)策略在不同魚類間高度保守。作者發(fā)現(xiàn)，斑馬魚來源的9GM也能將稀有鮈鯽胚盤細(xì)胞高效誘導(dǎo)為iPGC；將稀有鮈鯽iPGC移植入斑馬魚胚胎后，可以利用斑馬魚高效產(chǎn)出稀有鮈鯽iPGC來源的種間借腹生殖精子（圖3）。
圖3 稀有鮈鯽iPGC的高效誘導(dǎo)和iPGC移植種間借腹生殖
最后，作者試圖利用iPGC誘導(dǎo)和移植技術(shù)來解決魚類基因敲入實(shí)驗(yàn)中面臨的一個(gè)致命難題——即基因敲入效率與胚胎存活率之間的矛盾。作者注射大劑量的基因敲入元件，以在囊胚期獲得盡可能高的基因敲入效率；通過注射9GM，將這些攜帶有大量基因敲入事件卻無法存活的胚胎細(xì)胞全部誘導(dǎo)為iPGC；再將這些iPGC移植入野生型受體胚胎，最終利用高存活率的野生型受體魚高效產(chǎn)生出了基因敲入的配子（圖4）。基因敲入與iPGC誘導(dǎo)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的成功，從根本上提升了斑馬魚基因敲入實(shí)驗(yàn)中的種系傳遞效率。
圖4 通過iPGC誘導(dǎo)和移植顯著提升基因敲入的種系傳遞效率
這一魚類iPGC誘導(dǎo)理論和技術(shù)的突破，真正解決了魚類PGC移植中供體PGC來源的瓶頸，不僅為斑馬魚等魚類基因功能研究提供了更為強(qiáng)大的工具，而且可用于養(yǎng)殖魚類的iPGC移植高效借腹生殖精準(zhǔn)育種。相關(guān)成果發(fā)表于Nature Communications雜志，中國科學(xué)院水生生物研究所王小四特別研究助理為論文第一作者，祝俊雯博士、王厚鵬工程師等參與該項(xiàng)研究，孫永華研究員為通訊作者。論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-43587-3。這項(xiàng)研究受到國家杰出青年科學(xué)基金、國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、中國博士后科學(xué)基金等資助。據(jù)悉，文中用到的斑馬魚和稀有鮈鯽來自于國家水生生物種質(zhì)資源庫國家斑馬魚資源中心，相關(guān)載體也已保藏至該中心，并通過該中心對學(xué)術(shù)界提供相關(guān)資源和技術(shù)服務(wù)。
附：斑馬魚iPGC高效誘導(dǎo)和移植實(shí)驗(yàn)視頻
參考文獻(xiàn)：
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Zhang, F., Li, X., He, M., Ye, D., Xiong, F., Amin, G., Zhu, Z., and Sun, Y.* (2020). Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. Journal of Genetics and Genomics 47, 37-47. (Faculty 1000推薦論文)
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