基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)可以精準(zhǔn)定向地對(duì)植物的基因組進(jìn)行編輯來(lái)獲得目標(biāo)突變體，已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究和精準(zhǔn)育種的重要工具，具有重要的理論研究?jī)r(jià)值和生產(chǎn)實(shí)踐意義。高羊茅(Festuca arundinacea Schreb., 2n = 6x = 42, PPG1G1G2G2)作為一種重要的冷季型草坪草和牧草，已經(jīng)被全世界廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)和生活中。然而夏季的極端高溫天氣，極大地影響了高羊茅的草坪質(zhì)量和應(yīng)用價(jià)值。但由于其自交不親和的異源六倍體的特性和較大的基因組 (約6 gigabases)，使其在遺傳修飾和改良方面具有巨大的挑戰(zhàn)。因此，能夠同時(shí)針對(duì)幾個(gè)同源基因進(jìn)行編輯的高效的基因組編輯工具，是解決這一瓶頸問(wèn)題的關(guān)鍵。

　　中國(guó)科學(xué)院武漢植物園草坪草與牧草分子育種學(xué)科組在國(guó)際植物學(xué)期刊Journal of Integrative Plant Biology 上，發(fā)表了題為“Simultaneous gene editing of three homoeoalleles in self-incompatible allohexaploid grasses”的研究論文。該研究利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a (Cpf1) 系統(tǒng)獲得了高羊茅基因的三個(gè)同源等位基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化突變體，成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)異源六倍體高羊茅的基因編輯。這一工作開(kāi)啟了利用基因編輯工具進(jìn)行草坪草分子育種序幕。 

　　該研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的兩個(gè)sgRNA(sgRNA1和sgRNA2)對(duì)于FaPDS基因的編輯效率分別為83.9%和73.1%；而LbCas12a對(duì)于FaPDS基因的編輯效率13.6%-61.5%，比Cas9系統(tǒng)略低。因此選擇Cas9系統(tǒng)對(duì)高羊茅的小分子熱激蛋白FaHSP17.9進(jìn)行基因編輯，獲得了fahsp17.9-3和fahsp17.9-7兩個(gè)關(guān)于高羊茅三個(gè)同源等位基因移碼的突變體。通過(guò)熱脅迫處理發(fā)現(xiàn)，小分子熱激蛋白突變體fahsp17.9-3和fahsp17.9-7與野生型相比表現(xiàn)出明顯的不耐熱表型，草坪質(zhì)量、光合Fv/Fm和葉綠素水平也顯著低于野生型。葉綠素a熒光(OJIP)分析表明，在熱脅迫下，突變體的J-I-P步驟比野生型受到更嚴(yán)重的影響，這表明在脅迫下突變體的PSII活性受到了更嚴(yán)重的破壞。fahsp17.9溫敏突變體可作為鑒定高羊茅耐熱性表型的參考材料，也可與其他高羊茅種質(zhì)雜交，進(jìn)一步加快了高羊茅耐熱性新種質(zhì)的選育進(jìn)程。 

　　武漢植物園草坪草與牧草分子育種學(xué)科組的胡濤副研究員，陳良研究員以及上海逆境中心的趙楊研究員為本論文的通訊作者。武漢植物園博士生張亮和聯(lián)培生王濤為該論文的共同第一作者。該論文得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和山東省重大科技專項(xiàng)的資助。 

　　論文鏈接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/jipb.13101 

圖1. 利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a (Cpf1) 系統(tǒng)成功對(duì)高羊茅FaPDS基因3個(gè)拷貝進(jìn)行編輯 

圖2. CRISPR/Cas9編輯的fahsp17.9突變體呈現(xiàn)對(duì)高溫敏感表型，高羊茅基因編輯育種模型